## NCI-H1975人肺腺癌细胞培养指南

### 一、细胞培养条件

细胞名称：NCI-H1975人肺腺癌细胞

生长特性：贴壁生长

冻存条件：无血清冻存液

培养体系：1640培养基 + 10% FBS

传代方法：首次建议1:2传代，具体传代情况可在2天后更换培养基。

备注：请使用无菌离心管收集瓶子中的培养基，留作后续培养之用。

### 二、细胞处理

收到细胞后，应培养至适宜状态，并完全充满培养液后密封瓶口，以确保细胞运输的最佳状态。收到细胞后，请先用75%酒精消毒整个细胞瓶，随后在超净台内进行无菌操作。将细胞瓶放入37℃、5% CO2培养箱内静置3-4小时，以便细胞适应新环境，再进行后续处理。使用显微镜观察细胞生长情况，并拍摄不同倍数的照片保存（建议40x、100x和200x各一张）。前三天的照片为重要售后依据，未提供照片视为收到状态良好。EVO视讯建议在培养瓶放入培养箱时，松动瓶盖以促进气体交换。

### 三、细胞培养步骤

#### a. 细胞传代

如果细胞未超过80%汇合度，请将培养液收集至离心管中，保留5ml完全培养基在37℃、5% CO2环境中培养；如果细胞密度超过80%，可进行传代，步骤如下：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml至培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟后，观察细胞状态；若大部分细胞变圆并脱落，迅速取回并轻敲瓶底，添加5ml以上的完全培养基终止消化。
3. 轻轻吹打细胞，至完全脱落后吸出，转移至15ml离心管中，1000RPM离心5分钟，弃去上清，补加1-2ml完全培养基重悬。
4. 将细胞悬液按1:2比例分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2培养箱中培养。

#### b. 细胞冻存

1. 当细胞覆盖培养瓶的80%面积时，弃去T25培养瓶内培养液，并用PBS清洗细胞一次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml，待细胞回缩变圆后立即加入5ml完全培养基终止消化，再轻轻吹打细胞使之脱落，转移至15ml离心管中，1000RPM离心5分钟。
3. 弃上清，加入1ml EVO视讯提供的无血清冻存液（货号：C7001），混匀后装入冻存管。
4. 将冻存的细胞直接放入-80℃冰箱，若需转入液氮罐中，需在-80℃冰箱存放24小时后再转移。

#### c. 细胞复苏

1. 从液氮中取出冻存管（注意佩戴防护面具），迅速置入37℃水浴中解冻，直到冻存管中无可见冰晶，随后用75%酒精擦拭外壁。
2. 将冻存管中的细胞转移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000RPM离心5分钟。
3. 弃上清，加入5ml完全培养基重悬细胞，接种至T25培养瓶，放于37℃、5% CO2培养箱中。
4. 第二天更换为新鲜完全培养基继续培养。

### 四、注意事项

某些细胞特性较为特殊，贴壁不牢牢，运输过程中容易脱落，这是正常现象。请将培养瓶内所有培养液收集至离心管，进行1000RPM离心5分钟，随后使用胰酶1-2ml处理沉淀细胞，轻轻吹打后重悬，消化1-2分钟，结束反应后离心，弃上清，重悬于1-2ml完全培养基中，根据1:2比例进行分瓶传代（两个T25），补充新培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2培养箱继续培养。

### 五、售后条款

1. 如果细胞出现问题，可重发的情况包括：

1. 细胞在运输过程中遇到丢失、瓶身破损、培养液严重泄露等情况，皆可重发。
2. 如收货48小时内发现细胞污染问题，需提供真实实验结果，核实后予以重发。
3. 常温发货的细胞在静置24小时后及干冰冻存发货的细胞复苏后24小时内，若大多数细胞未存活（需提供清晰的细胞状态照片），均可重发。
4. 干冰冻存发货的细胞在复苏后24小时内或常温发货的细胞静置4小时后出现污染，可重发。
5. 细胞活性问题需在收到产品7天内提供真实实验结果，通过台盼蓝染色法检测细胞活力，确认后可重发。
6. 在收到细胞当天及随后的第2、3天内撰写照片证据，若3天后未告知，则视为产品合格。
7. 如4-7天内发现问题，并提供收到细胞前3天照片以及相关操作的详细步骤，经过技术人员确认属于我方责任的，予以重发。若属于双方共同责任，则需协商解决或按合同价的50%收取重发费用。

2. 细胞出现问题，不予重发的情况包括：

1. 客户造成的细胞污染，不提供重发。
2. 客户操作不当导致细胞状态不佳，不提供重发。
3. 非本库推荐的细胞培养体系导致细胞状态不佳，不提供重发。
4. 未提供细胞培养前三天的照片，细胞状态不好，无法重发。
5. 培养过程中的其它处理情况，不提供重发。
6. 收到后2天内未告知，不提供重发。
7. 具体情况视情况而定。