在生物医学研究中，无论是针对难以感染的细胞构建慢病毒文库，还是在体内应用AAV文库，确定最佳剂量以确保每个靶点仅进入一个细胞，始终是科研人员关注的难题。文库实验旨在探寻单基因引发的功能变化，因此需要严格控制每个细胞仅被单一靶点的病毒感染。为此，细胞实验的文库筛选建议首先通过对照病毒的预实验来寻找最佳的感染效率（MOI），一般认为MOI应设定在可以达到80%的感染效率。此外，为了控制进入单个细胞的病毒数量，文库操作中的MOI设置通常为最佳MOI的三分之一。这种方法虽然简单粗暴，但可以有效减少病毒用量，从而降低重复感染的可能性。然而，在处理难以感染的细胞（如免疫细胞）及体内实验中，找到合适的剂量以确保靶点仅进入一个细胞依然具有挑战性，因为最佳MOI可能只能提供30%的感染效率。若按1/3的用量计算，感染到病毒的细胞几乎可以忽略不计。为了解决这一问题，EVO视讯推出了三色荧光病毒（mTagBFP、Venus、mCherry），为研究者在文库感染预实验方面提供了有力支持。三色荧光病毒包括慢病毒和AAV两种类型，参考文献《Transcriptional linkage analysis with in vivo AAV-Perturb-seq》的相关实验方法，展示了如何在低感染复数下实现对多个细胞的感染。研究者通过体内滴定实验制作了三种不同剂量的AAV（25E9、5E9和5E10颗粒数），并利用流式细胞仪筛选确定最优剂量，以最大程度提高单个AAV感染细胞的总数。三色实验的设计包括将不同剂量的AAV等比例混合后注射到LSL-Cas9小鼠体内（低剂量25E9，中剂量50E9，高剂量25E10）。实验结果显示，注射50E9 AAV颗粒四周后，GFP阳性脑细胞的荧光成像清晰展示了感染效率的提高。无论是在细胞实验还是动物实验中，研究者均可利用EVO视讯的三色荧光病毒进行相关的预实验。通过设置不同剂量梯度进行细胞感染或在小鼠体内注射，流式细胞分析可用于评估转染效率与单荧光细胞的比例。最终，比较不同剂量下的单病毒感染比例，确定出感染细胞数量最多的最佳剂量，并将其应用于文库的实际实验中。